静电纺纳米纤维支架在牙髓再生中的应用

>2019-05-16 16:05  来源:口腔疾病防治
作者:张倩莉 袁重阳 王晓燕 阅读量:1201

    比年来,跟着构造工程与再生医学研究的赓续深入,牙髓再生已成为牙髓病治疗领域新的打破口及研究趋向。类似于构造再生,牙髓再生的基本计谋是将体外分离造就出的种子细胞植入适宜的支架资料,或募集机体内细胞归巢,并辅以一定的生物活性分子,促使其增殖分化构成相应的构造。此中,适宜支架资料募苹胗τ枚牙髓再生起着关键感化。

    大批研究表明,纳米纤维情势的支架,因为具有极高的比外面积,不只可增进细胞黏附,进而影响细胞迁移、增殖、分化及功效的表达,而且当负载生物活性分子时,还能节制药物的缓释感化,因此,纳米纤维已成为支架资料的研究热门。

    目前,常见的纳米纤维制备办法包含自组装法、热致相分离法及静电纺丝技术。自组装法是分子间颠末过程非布鄹谢自发地构造或丛聚构成具有特异布局和状况的全体。这种办法制备获得的纳米纤维支架具有生物相容性好、纤维直径细、多可打针等优点,但其难以调控微观布局、机械机能差、所用质料受限等不敷制约了其进一步睁开。

    热致相分离法是颠末过程节制聚合物溶液的温度,来介导聚合物?溶剂发生相分离,随后去除溶剂,聚合物结晶构成多孔网状的纳米纤维支架。颠末过程改变制备过程的各项参数,可以或许或许一定程度调控支架的孔隙布局及纤维直径。该制备办法常必要应用大批的无机溶剂,存在潜在的生物毒性。

    别,上述两种办法产量较低,均难以大规模制备纳米纤维支架。静电纺丝技术仅需利用高压静电场即可获得超细纤维,其便利、简略和高效,是目前唯一可以或许或许间接连续制备聚合物纳米纤维的技术,具有批量临盆的可能。更重要的是,利用静电纺丝技术能精细的调控纳米纤维支架的微观形貌,包含纤维直径、纤维取向、孔隙布局等,从而在纳米尺度充足模拟自然细胞外基质的布局,增进构造再生,目前已被普遍应用于构造工程领域,被认为是有望在构造再生领域获得严重效果的技术之一。因此,本文将对静电纺纳米纤维在牙髓再生中的应用停止综述及瞻望。

    1.静电纺丝技术概述

    静电纺丝技术是一项利用高压静电场,使聚合物熔体或溶液构成超细纤维的技术,其典型的装配重要由三部分构成:喷丝头,内含聚合物熔体或溶液;高压电源,用于供给数千伏到十几万伏的高压静电。接收装配,用于接收喷射出的纤维。在静电纺丝的过程中,带有电荷的聚合物溶液离开喷丝口,在电场力感化下,高分子溶液外面带上电荷并发生了电场力,溶液的外面张力与电场力相反。当外加电压较小时,悬挂在喷丝口的液滴被拉长为带电锥体,即“泰勒锥”,跟着电压增长,当电场力足以克服外面张力时,喷射流从带电锥体顶部收回,沿着电场偏向加快喷出,颠末一段稳固的直线运动后,纤维开端出现不规矩的运动,弯曲震荡并最终拉伸成为很细的单根纤维到达接收板。喷射流在空气中运动的过程中,阅历溶剂挥发、纤维固化等过程,末了在接收板上获得高分子超细纤维膜。

    迄今为止,利用静电纺丝技术已经实现多种聚合物纳米纤维的制备,包含合成高分子、自然高分子、无机物资料及各种复合股料。实践上来说,对付各种高分子资料,只要找到合适的溶剂体系,均可利用静电纺丝技术获得纳米纤维。同时,静电纺丝技术还能颠末过程调剂纺丝液参数、临盆条件及环境参数等,实现对纳米纤维的尺寸及形貌的调控,从而最大限度地模拟细胞外基质的布局。

    目前,利用静电纺丝技术制备的纳米纤维支架已普遍应用于骨、软骨、肌腱、神经、血管、皮肤、肌肉等的构造工程领域,而电纺纳米纤维支架在牙髓再生中的研究方兴未艾。

    2.静电纺纳米纤维支架应用于牙髓构造工程

    众所周知,构造工程中最关键的三个要素为细胞、支架和生物活性分子。此中,支架作为种子细胞的载体,为细胞的定植、黏附、增殖、迁移和分化等生物学行为供给机械支撑,同时,支架还可负载生物活性分子,共同构成细胞赖以生长的微环境,进而调控细胞功效,对牙髓再生起着关键感化。支架的感化可以或许或许从其资料成分及布局两方面来停止考量。

    2.1支架资料

    抱负的支架资料首先应具有优越的生物相容性和无毒性,可支撑细胞的黏附、增殖、只黄浯,支架资料应具有优越的生物活性,这对毒调控细胞的生物学行为也是非常必要的;别的,支架资料还应具有可降解性,不只可防止植入资料的再次取出,同时还应与构造重生的速率相匹配,增进构造再生。

    2.1.1支架基础成分

    在牙髓再生中常用的支架资料可分为两大类:一类是自然高分子,如好鹘骸⑺克氐鞍住⒖聚糖等,其最大的优势在于含有可增进细胞黏附、增殖、分化的活性基团,具有较好的生物相容性和生物活性。但是因为纯自然高分子可纺性相对较低,机械机能欠佳,资料后处理难度大等原因,限制了纯自然高分子电纺支架资料的生物应用。目前,在牙髓再生领域,尚未见纯自然高分子电纺支架资料的应用报导。另外一类是人工合成高分子资料,如聚己内酯(polycaprolactone,PCL)、聚左旋乳酸(polyLlacticacid,PLLA)、聚乳酸-羟基乙酸共聚物(polylactic-co-glycolicacid,PLGA)、聚二氧六环酮(polydioxanone,PDS)等,其具有优越的可加工性、机械机能及生物相容性。

    此中,根据资料的可降解程度,可将人工合成高分子资料进一步细分为不行降解资料和可降解资料。可降解支架资料能被周围构造逐渐接收,防止了植入支架的再取出,因而遭到了普遍存眷。研究发现,颠末过程调节静电纺丝过程中的各项参数,可有用节制可降解纳米纤维支架的降解速率,使其与构造重生速率相匹配,从而增进构造的再生。因此,目前可降解人工合成高分子资料获得了相对普遍的应用。

    Deng等将人牙髓上胞(human dental pulp stem cells,hDPSCs)接种到电纺PLLA支架上,体外造就1d后观察到hDPSCs在支架上黏接越,细胞状态由圆形向纺锤形过渡。Cai等将猪牙源性上皮细胞和人牙源性间充质细胞混合后,与PLGA/PCL电纺支架复合,体外共造就28d后,可见细胞在支架上生长优越,实时荧光定量核酸扩增检测结果显示成釉、成牙本质、成骨分化相干基因表达优越。

    因为合成高分子资料缺乏协助调控细胞行为的活性基团,而支架外面疏水性、外面电荷、外面化学官能团等均会影响细胞在支架上的黏附生长行为。目前研究者咱咱们偏向于利用共纺、同轴电纺、外面涂层修饰等办法复合应米然高分子及人工合成高分子资料,如:PCL/明胶、丝素蛋白/PCL,即颠末过程结合两类资料的自己优势,获米合机能更佳的电纺纳米纤维支架资料,这已成为目前的研究趋向。

    为了克服单纯PCL电纺支架疏水性对细胞黏附的不利影响,有学者将亲水的壳聚糖/海藻酸钠复合体自组装于疏水性的PCL电纺支架外面,在体外增殖试验中颠末过程扫描电镜观察发现,与单纯PCL支架相比,经壳聚糖/海藻酸钠自组装处理后的PCL电纺支架,黏附的牙髓干细胞数目更多,细胞铺展的面积更大,并可见细胞有显著向支架内部迁移生长的趋向。

    2.1.2支架资料改性

    牙髓干细胞在体内增殖和分化为牙髓-牙本质复合体的过程,受多种生物信号分子的多级调控和互相影响。为尽量模拟体内细胞微环境,研究者常颠末过程加入生物活性分子,如无机粒子、生长因子等,对支架资料停止修饰改性,以期增进牙髓干细胞的黏附、增殖、分化和矿物构成。目前,常用的生物活性分子重要会合于无机粒子和小分子药物,且均是颠末过程共纺离开达支架资改性的偏向,行将生物活性分子与高分子聚合物溶解于相同的溶剂中停止静电纺丝。

    陶瓷类资料是最常纺入的无机粒子类生物活性分子,如羟磷灰石、磷灰石、氟磷灰石、磷酸钙、生物活性玻璃等,其具有与牙本质相似的矿物成分,能模拟牙本质矿物晶体,供给丰富的钙离子及磷酸根离子,从而增进牙髓干细胞的黏附、增殖、成牙本质向分化及矿物基质构成。别的,Bottino小组比年来胜利将TAP(环丙沙星Ciprofloxacin,CIP、甲硝唑Metronidazole,MET、米诺环素Minocyline,MINO)三联抗生素糊剂中的一种或多种小分子药物成分纺入纳米纤维,实现为了长达14d的中性药物释放,表示出对牙龈卟啉单胞菌、具核梭杆菌、粪肠球菌、内氏放线菌等细菌及其生物膜的优越的抑菌效果,同时其局部药物浓度远低于临床常用浓度(1g/mL),表示出对人类牙髓干细胞更小的毒性,有望为后续的牙髓再生过程供给生物相容性优越的抑菌环境。

    但是,因为纺丝过程中无机溶剂和高电压的影响,共纺这种改性办法可能会丧失蛋白质、多肽等生物大分子的活性,限制了其应用。一种可行办法是将这类药物停止物理或化学的外面固定化处理,即可防止由溶剂及高电压所带来的药物变性,这种办法已在其余领域获得了普遍应用。与此同时,Bottino小组将具有管腔布局的埃洛石纳米管与PDS共纺停止外面改性,体外试验表明这种埃洛石纳米管自己对细胞的增殖无显著影响,而它的纺入增强了支架自己的机械机能;同时其管腔内可容纳生物活性分子,削减纺丝过程对药物活性的影响。尽管目前载入生物活性分子这部分还未见跟进的研究报导,但这不失为一种可行的研究思绪。

    2.2支架布局

    抱负的支架布局首先应具有三维多孔性,便于供给营养物质和排出代谢废物,从而增进细胞的生长和长入;其次,支架还应具有一定的物理机械机能,以械比维模板感化,引导构造重生。颠末过程调控静电纺丝过程中的各项参数,可节制支架的纤维直径、纤维取向、孔径/孔隙率等以最大限度地顺应牙髓构造工程。

    2.2.1纳米纤维布局

    颠末过程改变纺丝液的种类、浓度,节制临盆参数,可获得直径从纳米到微米不等的超细纤维。研究表明,这种纳米纤维性布局对细胞的黏附、增殖、分化及其余功效的表达起着非常重要的感化。Woo等比较了PLLA纳米纤维三维多孔支架与光滑孔壁的多孔支架,发如今相同孔隙率条件下,纳米纤维支架对细胞外基质蛋白的吸附量大幅提高,如纤连蛋白、玻连蛋白、层粘连蛋白等,有用地增进细胞的初期黏附。别的,大批的蛋白吸附可能上调剂纤的表达,进一步增进细胞与细胞外基质的互相感化,增进细胞的增殖、分化及功效表达。

    Wang等制备了具有相似孔径及孔隙率的PLLA纳米纤维支架与光滑孔壁支架,体外试验发现人牙髓干细胞莳植于纳米纤维支架上表示出更高的增殖活性,成牙分化标识基因(如碱性磷酸酶、骨钙素、牙本质涎磷蛋白等)表达更活跃,且矿化物沉积更丰富。在体内试验中,纳米纤维支架组也构成为了加倍致密的血管化的纤维结缔构造。

    2.2.2纤维取向

    在静电纺丝的过程中,颠末过程节制接收装配及高压电场,可获得无定向或定向的纳米纤维支架,而纳米纤维的取向程度会影响支架的机械机能和细胞纳ば为。已有大批研究发现,定向纤维支架可增进人体内高度取向构造的再生,如血管、骨骼肌、神经等。在牙髓构造中,成牙本质细胞、成纤维细胞等都呈规律性排列,即具有一定的取向性,因此,取向纤维在牙髓再生领域具有优越的远景。

    vanManen等用静电纺丝技术分离制得PLLA的无定向及取向性的纳米纤维支架,颠末过程观察并比现牙蕾细胞在分歧支架上的细胞行为,阐发纤维取向性对细胞排列及矿化基质沉积散布的影响。研究发现,在造就初期,细胞在取向纤维膜呈现纺锤形,且沿着纤维长轴充足伸展延长,而在无取向纤维支架上,细胞状态更加紧缩,在大批无序的纤维中随意生长。但跟着造就光阴的延长,因为细胞生长逐渐交融成片,纤维的取向则对细胞排列、矿化基质沉积散布无显著影响。取向纤维在细胞远期造就无显著感化,可能与上述研究难以精细模拟牙髓发育过程中的细胞微环境无关,并不能因此否定取向纤维对牙髓再生的研究价值。因此,如何充足利用取向纤维在细胞造就早期的引导感化,从而获得规律性排列的牙髓构造,值得进一步研究。

    2.2.3孔径/孔隙率

    在构造再生中,具有合适孔径及孔隙率的支架,可增进胞外基质的构成、氧气和营养物质的传输、代谢物的排泄和血管和神经的内生长,从而利于细胞的黏附、迁移、增殖和分化过程。然而,电纺纳米纤维间接用于构造再生支架最大的缺点在于其排列较为慎密,纤维之间空隙较小,其孔径大小仅为3nm~6μm,限制了细胞的长入。有文献报导,只要小的纳米粒子(直径小于300nm)可以或许或许穿过静电纺无纺布的膜,而大的粒子(直径大于1μm,如牙髓细胞)则被截留。根据Eichhorn和Sampson构建的实践模子,当纳米纤维支架直径小于100nm时,类似二维平面片状物,细胞仅在支架的外面迁移、生长,而无法构成具有一定厚度的三维构造。

    对付牙髓再生所用的种子细胞,其细胞直径多为数十微米,所需的支架最适孔径虽然尚无明白的定论,但适当的增大孔径以增进细胞的迁移和长入通常来说是有用的。目前,大批相干研究基本仍是采纳二维无纺布情势的电纺纳米纤维支架用于牙髓构造工程,细胞的黏附、增殖及后期骨样硬构造及矿化物的沉积均局限于支架外面,而未能深入支架内部。

    为了解决这一成就,比年来研究者咱咱们采纳了多种办法来扩大电纺纳米纤维支架的孔径,从而增进细胞长入,重要包含:沥滤法、高温电纺、湿法纺丝、激光刻蚀法,微/纳米纤维复正当、超声法。Cai等利用湿法纺丝结合超声法,取得了厚度约1mm的大孔径PLGA/PCL三维纤维支架,不只增进了猪牙源性上皮细胞、人牙源性间充质细胞的分化及互相感化,在体外试验中还可见这两种细胞均有用地长入三维PLGA/PCL支架内部,并贯通支架全层。但是因为纤维支架直径过粗,平均直径达2μm,因而未能充足表现静电纺纤维纳米尺度的优势。别的利用湿法纺丝可扩大孔径的程度有限,在当支架厚度进一步增长时,细胞的长入深取⒑笃谘芑细胞功效表达及体内试验的效果均有待进一步研究。

    3.总结与瞻望

    静电纺纳米纤维支架凭仗其高孔隙率、高比外面积,可以或许一定程度模拟细胞外基质微环境,在牙髓再生领域表示出精实生物相容性和生物活性,具有极大的应釉勖潜力。目前,大批的体外研究已证实静电纺纳米纤维支架应用于牙髓再生的可行性及优越性,并对支架适宜的成分和布局停止了开端探究,但尚缺乏对牙髓再生感化机制纳钊研究,且有待进一步植物试验及体内研究结果的证实。别的,在现有的研究条件下,利用静电纺纳米纤维支架停止牙髓再生仅取得了无规律的类成牙本质细胞及骨样硬构造,距离获得血管化的牙髓样构造仍任重道远。未来研究应着重于抉择合适的静电纺丝支架资料、利釉勖恰当的办法扩大支架的孔径、改良支架的三维布局等,并辅以合实生物活性分子充足模拟体内的微环境,从而更好地诱导种子细胞迁移、增殖、分化,实现牙髓构造的再生。

编辑: 陆美凤

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