自然支架资料在牙髓构造工程再生中的研究进展

>2019-05-16 10:05  来源:国际口腔医学杂志
作者:李龙飚 汪成林 叶玲 阅读量:1459

    构造工程的睁开为牙髓再生带来了新的盼望,构造工程必要具有如下3个条件:干细胞、生长因子及支架。此中,支架扮演着重要感化,可作为细胞运输的载体,为细胞代谢供给三维空间环境,并在细胞外基质的构成过程中被逐渐降解。抱负的牙髓再生构造工程支架应最大程度对牙髓构造中的细胞外基质停止仿生,具有如下特色:1)优越的生物相容性及生物平安性;2)可降解,降解产品无毒无害,降解的速率与胞外基质的构成速率相匹配;3)具有疏松多孔的布局,孔隙率适宜,空隙之间互相联通,有利于细胞的黏附、营养及代谢产品的转运;4)抱负的外面特性,有利于细胞的黏附;5)可颠末过程一系列分子信号影响细胞的行为及诱导特异表型的表达;6)因为感染根管内的感染无法完全去除,支架资料应该具有一定的抗感染能力。

    目前应用于牙髓再生研究的支架资料重要有人工合成高分子资料及自然资料两大类。人工合成高分子资料通常具有较好的力学强度及加工机能,但亲水性和细胞活性较差,体内降解缓慢,目前仅见体外造就、裸鼠皮下移植、小鼠冠髓切除后部分牙髓再生,尚未见人体应用。自然资料是指从动植物构造中提取目降解资料,其特色是与细胞外基质相似度高,或自己便是细胞外基质的构成部分,通常具有优降生物活性、亲水性、资料与细胞界面相容性。目前利用自然资料停止牙髓再生已有胜利的临床病例及相干的植物试验,本文将对常用自然资料在牙髓构造工程再生中的研究进展作一综述。

    1. 胶原

    胶原是人体最重要的布局蛋白,目前已鉴定的胶原有19种,构造工程常用的为Ⅰ型胶原。胶原不溶于水,但可在稀酸中发生溶胀而构成胶体,处于溶胀状况的胶原又可在一定条件下从新交联而构成凝胶。胶原是一种抗原性极弱的蛋白质,颠末过程酶解法提取可进一步低落其抗原性。研究表明:作为胞外基质的重要成分,胶原不只为细胞供给一个简略的附着支架,同时也是细胞信息的载体,可与细胞之间停止分子信号的传递,进而影响细胞的生物学行为。

    目前,应用于牙髓再生的胶原重要从牛或猪的皮肤及腱鞘中提取,对峙了自然空间布局的块状胶原,作为可接收基质应用于牙髓血运重建术,有增进凝血的感化并为三氧化矿物聚合物(mineral trioxide aggregrate,MTA)的冠方充填供给支撑。胶原在牙髓再生治疗中的优势重要为人体应用成熟,有商用胶原支架资料,如Colla-Plug、Collacote?CollaTape等;有胜利的临床病例支撑其效果,但顺应证仅限于根尖孔未闭合的年青恒牙;可制成水凝胶,有颠末过程打针的办法停止牙髓再生治疗的可能性,临床应用便利;缺点为力学机能差,降解速率较快,但是因为牙髓构造自己不必要受力,牙髓再生对付支架资料的力学机能请求较低,这部分弥补了胶原支架的缺点。

    胶原是目前在牙髓再生中应用远景最为抱负的支架资料,对胶原的研究重要会合在对资料停止改性,进一步扩大细胞运载能力及增长生物刺激,增进细胞的黏附、增殖、分化等;对其余资料停止外面改性,如对聚乳酸停止胶原外面覆盖,结合了聚乳酸优越的加工机能及胶原优越的亲水性及生物活性;尝试应用凝胶态胶原,结干细胞及生长因子,拓宽牙髓再生治疗的顺应证,如根管治疗后的成熟恒牙、底侧穿修复等;应用胶原作为支架,尝试颠末过程干细胞疗法再生牙髓,一些学者利用去端肽胶原作为构造支架,率先停止了牙髓再生干细胞疗法的后期临床试验,取得了一定的效果,5例发育成熟后感染不行逆性牙髓炎的单根牙中,4例检测到了牙髓电活气阳性,3例可观察到功效性牙本质的发生。

    2. 血凝块、富血小板血浆(platelet-rich plasma,PRP)、富血小板纤维蛋白(platelet-rich fibrin,PRF)

    19世纪60年月,Ostby由血凝块构成是身体其余部位构造缺损修复的起始获得启发,率先尝试了在扩大根尖孔的根管内引进血凝块停止牙髓再生,观察一段光阴后,临床可见症状消除,影像学可见根尖孔闭合,构造学检查见根管内构成结缔构造,但未见成牙本质细胞。Ostby开启了颠末过程根尖区引血停止牙髓再生的大门,并逐渐演化成为了如今的牙髓血运重建术,应用于根尖孔未发育成熟的年青恒牙,取得了较好的临床效果。

    血凝块取材便利,不必要体外操纵,颠末过程引血可以或许或许带入一定量的干细胞,血液凝固后可构成三维的纤维支架,自己即包含了生长因子,是优越的牙髓再生自然支架,但仍遭到某些缺点的限制,如某些环境引血较为艰难、生长因优ǘ不够高、血细胞死亡后释放出的酶可能会影响干细胞生长取

    PRP是利用血液中各个组分沉降系数分歧,颠末过程将全血梯度离心制得的血小板浓缩产品,其血小板的浓度是全血的4~5倍。颠末过程血小板脱颗粒和凝血感化,PRP可构成纤维蛋白三维支架并释放大批生长因子和蛋白质等生物活性因子,这些活性因子可以或许介入细胞的迁移、增殖、分化,具有调节免疫应答和构造愈合的感化。颠末过程改变制备工艺可使PRP含有一定量的白细胞,使其具有一定的免疫防御及炎症对抗效果。

    PRF是继PFP之后的新一代血小板浓缩产品,具有与PRP相似的优点,分歧的是在制备过程中,PRF不必要添加任何外源性添加物,保留了更多的纤维蛋白原,这使得PRF防止了外源性添加物(如抗凝剂等)潜在的免疫原性和对付构造再生的克制感化。PRF凝血过程及生长因子释放过程加倍接近生理状况,发生的纤维蛋白支架加倍艰韧有弹性,生长因子的释放加倍匀速持久。

    因为PRF在制备过程中不添加外源性的抗凝剂,在抽血后的数分钟内就会构成纤维蛋白凝块,因此,通常环境下,PRP以液状、PRF以凝胶状作为构造工程支架,这限制了PRF在不规矩地区(如根管)构造工程中的应用。比年来,颠末过程对制备工艺的改良,如低落离心转速等,已有学者开拓出了可打针的PRF,让PRF在可打针的同时具有更高含量的血小板、白细胞及生长因子。

    应用于牙髓再生,PRP和PRF可单独或许结合血凝块应用于牙髓血运重建术,临床治疗过程和构造再生办法与单独应用血凝块相似,均有胜利的临床病例报导,颠末过程植物试验停止的构造学研究进一步证实了PRP、PRF应用于牙髓再生的效果,但是对付血凝块、PRP、PRF应用血运重建的效果优劣比较目前尚无定论。尚未见可打针PRF应用于牙髓再生的报导。

    3. 壳聚糖

    壳聚糖又称脱乙酰甲壳素,由普遍存在于甲壳类植物外壳中的几丁质颠末脱乙酰感化制成。壳聚糖布局中的N-乙酰基葡糖胺普遍存在于细胞外基质的糖胺聚糖中,具有和糖胺聚糖类似的生物活性。壳聚糖无毒、无刺激,生物平安性优越,是一种带正电荷、高电荷密度的碱性多糖,能与很多水溶性带负电荷的物质(如DNA、糖胺聚糖、糖蛋白等)天生聚合物。植入体内后,在生理pH条件下,聚合物可部分解离,这使得壳聚糖可作为带负电荷的生物活性物质的控释载体。

    壳聚糖还可表示出类似抗生素的广谱抗菌感化,有利于根管消毒。但壳聚糖自己降解速率较缓慢,且无法调节,加工机能差,这限制了壳聚糖作为构造工程生物支架的应用。2014年,Li等将壳聚糖制成一壁致密、一壁疏松的双层膜布局,并在疏松面运载转化生长因子-β1(transforming growth factor-β1,TGF-β1),在比格犬上停止间接盖髓试验。观察到在运载了TGF-β1的壳聚糖膜下可以或许构成更多的类成牙本质细胞,60 d后构成的修复性牙本质厚度为其余的3倍。

    随后,Farea等也发现:壳聚糖支架与TGF-β1具有协同感化,可共同增进脱落乳牙牙髓干细胞(stem cell from human exfoliated deciduousteeth,SHED)的增殖及成牙本质向分化。Soares等将壳聚糖和胶原共同制成多孔支架,以铝酸钙停止外面处理,接种牙髓干细胞后发现:相较于未停止外面处理的壳聚糖-胶原支架,停止外面处理后细胞黏附增殖更快,造就14 d后可见更多的基质矿物沉积及矿化相干基因的表达。目前的研究表明:如能克服或改良其缺点,壳聚糖具有相当宽广的应用于牙髓再生的远景。

    4. 透明质酸

    透明质酸是由N-乙酰氨基葡萄糖和D-葡萄糖醛酸交联而成的自然线性多糖化合物,亲水性优越,是细胞外基质的重要成分,具有优越的生物相容性、降解性和非免疫原性。研究表明和该质酸可以或许诱导碱性磷酸酶的分泌,上调骨钙素表达,与地塞米松、重组人骨状况发生蛋白-2互相感化,在骨髓基质细胞迁移、黏附、增殖、分化等方面发挥着重要感化。透明质酸能构成连续的三维蜂窝状网络布局,以水凝胶的情势作为构造工程支架,还可颠末过程冷冻干燥技术制备成孔隙率更高,力学性、弹性机能更好的固相网络支架资料。

    应用透明质酸作为支架资料面对的重要成就是高水溶性;对从容基及透明质酸酶敏感,易发生降解;接收敏捷,在体内保留光阴短;在水体系中缺乏力学强度。透明质酸在体外试验中对牙髓干细胞牙髓向分化有增进感化,但缺乏进一步的植物试验及人体试验,透明质酸虽具有应用于牙髓再生的潜能,但仍必要进一步的研究。Ferroni仍谕明质酸支架接种牙髓干细胞后停止三维造就,前后加入了成神经、成神经胶质、成上皮、成主相干刺激因子,旨在颠末过程三维造就中加入多种细胞刺激生长来构建一个多细胞种类的类牙髓构造;体外造就21 d后,可见多种细胞分化相干因子的表达,提醒牙髓干细胞向着多种细胞种类分化,支架外面及支架之间可见细胞外基质构成。

    Chrepa等对比了商用透明质酸水凝胶(restylane)和基底膜基质(matrigel)作为牙髓构造工程支架的效果,结果发现:在3 d的造就光阴内,2种支架资料均低落了细胞活性,但透明质酸造就3 d后细胞活性显著增高,且造就7 d后,透明质酸组的碱性磷酸酶活性更高,牙本质涎磷蛋白(dentin sialophosphoprotein,DSPP)、牙本质基质蛋白(dentinmatrix protein,DMP)-1、细胞外基质磷酸糖蛋白(matrix extracellular phosphoglycoprotein,MEPE)基因表达量更高。

    Inuyama等分离将透明质酸和胶原支架充填入冠髓切除后的小鼠磨牙内,对比了透明质酸和胶原应用于牙髓再生的效果差异,结果发现:两者效果相似,均有类牙髓构造构成,但透明质酸细胞密度更高,且粒细胞浸润更少。

    5. 丝蛋白

    丝蛋资墙丝或蛛丝提纯,去除糖基化蛋白后制备成的自然高分子资料。去除糖基化蛋白的丝蛋白具有优越的生物相容性,可颠末过程丝蛋白中晶状β-折叠片层布局的比例调剂资料的力学机能、降解和接收的速率,这为在支架资料的降解光阴与干细胞的增殖分化的光阴之间树立抱负的匹配相干供给可能。丝蛋白细胞黏附性优越,可能缘于丝蛋白肽链的C端亲水地区附近带有正电荷,而哺乳植物的细胞外面重要为带负电荷的基团,两者可互相吸引。丝蛋白肽链上另有大批重复的精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸序列,可作为哺乳植物细胞黏附辨认位点。

    目前,对付丝蛋自谘髓构造工程再生中的应用研究较少,但相较于大多数自然可降解资料,丝蛋白表示出了力学机能优越、可加工机能强等优势,未来是否可利用丝蛋白加工机能较强的特色增进牙髓再生效果仍需进一步的研究。相干的研究有2015年Yang等利用丝蛋白多孔支架制成牙片模子,并对比了碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growth factor,b-FGF)对牙髓干细胞增殖分化的影响,研究发现:体外造就28 d后,牙髓干细胞可在支架外面停止增殖,在支架外面和空隙之间可见矿物沉积,b-FGF的加入可以或许或许显著提高细胞增殖速率及增长矿物构成。裸鼠皮下植入7周后,b-FGF-细胞-支架组可见类牙髓样构造天生,构造血管化优越,类牙本质细胞在牙本质外面会合排列,有重生的矿化构造天生。细胞-支架组亦可见血管化的结缔构造天生,但细胞排列紊乱,未见矿物沉积天生。

    6. 脱细胞牙髓支架及牙本质支架

    尽管已经有一系列的支架资料利用于牙髓构造工程再生,但是目前尚没有一种支架可以或许完全模仿牙髓构造中的自然胞外基质,为细胞供给最接近自然状况的力学支撑及局部微环境。因此,有学者尝试颠末过程将牙髓脱细胞后或牙本质脱矿后制成支架,最大程度模仿牙髓细胞生计代谢的自然微环境。Ravindran等将人牙髓干细胞、人骨髓基质细胞、人牙周膜细胞分离接种于脱细胞牙髓支架,观察2周后发现:3种干细胞均可以或许在脱细胞牙髓支架外面黏附、增殖优越,在不额外添加生长因子的环境下,脱细胞牙髓支架可以或许单独促使3种细胞向成牙本质细胞向分化。

    Tran等将牙本质切块并去除玷污层后作为支架与人牙髓干细胞共造就,结果发现:颠末处理后的牙本质可观测到DMP的析出,细胞在牙本质外面分化增殖优越,胞外基质构成的同时伴随类牙本质天生。最新的研究中,Song等对比了3种分歧办法制成的脱细胞牙髓支架,结果发现:牙髓脱细胞后都邑形成细胞骨架蛋白和膜蛋白的完全破坏,胶原之间的交联程度轻微改变,且重要会合在牙髓成牙本质细胞层。从中挑选出布局破坏最小的支架后,将脱细胞牙髓支架、离体牙制成1 mm厚牙片模子,接种根尖周牙乳头干细胞(stem cell fromthe apical papilla,SCAP)造就2周后,结果发现:SCAP分化成大批纺锤样细胞,接近牙本质的SCAP状况加倍扁平,且伸出突起进入牙本质小管。

    虽然脱细胞牙髓支架是与自然状况最接近的支架资料,体外试验效果优越,但是应用于人体将面对资料来源有限、异体应用免疫原性的困境,因此其应用更多的属于实践研究。该方面的研究表明:根管周围的牙本质不但可以或许或许作为细胞支架,还可以或许或许作为一个细胞因子的来源,对其停止适当的处理有助于晋升牙髓再生的效果。

    7. 总结

    得益于牙髓构造自己不必要受力,和牙髓周围硬构造的包绕,牙髓再生对付资料力学机能请求较低,这给了自然资料加倍宽广的应用空间。在浩繁自然资料中,血凝块、PRP、PRF和胶原支架是目前应用较为抱负的资料,且均以牙髓血运重建术的胜利睁开为条件,具有代表性。其余自然资料的应用尚需临床试验的验证。而干细胞结合支架的后期临床研究,为支架应用供给了新的思绪。

编辑: 陆美凤

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